Cell：张泽民团队揭示结直肠癌免疫细胞治疗机理丨CellPress对话科学家
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生命科学
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基于T细胞开发的抑制剂药物，如PD-1抗体，在多种肿瘤治疗中取得良好疗效，然而在临床试验中，仍有部分患者无法获益，如基因组微卫星稳定（MSS）的结直肠癌病人[1-3]。除T细胞外，靶向髓系免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和树突状细胞（DC）的多项治疗策略已进入临床前试验。然而对结直肠癌肿瘤微环境中不同免疫细胞的特性，相互作用关系，及其靶向药物的作用机理认知的局限，极大地限制了免疫治疗策略的合理选择和有效使用。
近日，北京大学张泽民课题组联合北京大学人民医院申占龙课题组以及美国多位科学家，在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell（《细胞》）上以长文形式发表了题为"Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer"的研究论文。
该研究在单细胞水平对结直肠癌患者及小鼠模型的肿瘤微环境进行了系统性的刻画和比较，发现不同髓系免疫细胞对anti-CSF1R抑制剂治疗的敏感性差别迥异，找到对anti-CD40激动剂治疗有响应的DC和T细胞亚群，揭示了这两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理。
近年来，单细胞转录组测序技术为解析肿瘤微环境多样性提供了有力的武器，但在解析肿瘤免疫疗法的机制方面，相关的单细胞水平研究还很匮乏。为此，研究人员首先使用Smart-seq2和10x两种单细胞转录组测序技术，对从结直肠癌患者中收集的免疫和非免疫细胞进行单细胞转录组测序，从中鉴定出包括T细胞、B细胞、先天性淋巴细胞（ILC）、髓系细胞、上皮细胞、成纤维细胞等主要细胞类群及不同亚群（图1）。该研究首次对结直肠癌浸润髓系细胞类群的功能、谱系发育及细胞间相互作用关系进行了系统性地刻画。
▲图1 课题总体设计与免疫治疗作用机制
近期基于小鼠模型的研究发现[4, 5]，TAM细胞可由组织驻留巨噬细胞（RTM）和循环单核细胞进入组织后发育而来，但对于结直肠癌肿瘤患者中TAM的来源仍有待研究。研究人员发现结直肠癌组织中富集一群FCN1+的单核细胞样细胞，分析其可能是TAM细胞发育的前体。而相比乳腺癌中TAM细胞呈现出的连续功能状态[6]，该研究发现结直肠癌TAM细胞可以被分为SPP1+ TAM和C1QC+ TAM两个具有不同细胞功能的细胞类群 （图2）。其中，C1QC+ TAM可能发挥细胞吞噬和抗原呈递的功能，而SPP1+ TAM则发挥促血管生成及促进肿瘤转移的功能。值得注意的是，结合肠炎病人及健康受试者的单细胞转录组数据[7]，研究人员首次发现，SPP1+ TAM特异性地富集在结直肠癌病人癌组织中，提示其可能在结直肠癌肿瘤发生发展中发挥重要作用。
▲图2 结直肠癌中SPP1+ TAM和C1QC+ TAM的功能差异
免疫系统是一个复杂且具有高度动态性的可调节系统，理解免疫细胞与基质细胞和肿瘤细胞之间的相互作用关系可以为免疫治疗提供更加明确的指导。为此，研究人员结合Smart-seq2数据及TCGA和GTEx bulk样本，构建出结直肠癌“相关性关系网络（Correlative network）”，发现两群TAM细胞和两群经典的DC细胞（cDC）分别与不同类型免疫细胞，如T细胞，和基质细胞相互作用。该新颖的细胞间相互作用分析网络，有助于深入理解免疫细胞在肿瘤微环境中的不同功能。
基于以上对结直肠癌浸润髓系免疫细胞的深度解析，研究人员继而利用小鼠肿瘤模型来研究靶向不同髓系细胞对抗肿瘤免疫反应造成的影响，包括靶向巨噬细胞的anti-CSF1R抑制剂和靶向DC的anti-CD40激动剂。在获得小鼠肿瘤浸润免疫细胞图谱后，研究人员发现与结直肠癌病人相比，DC和T细胞亚群在人和小鼠肿瘤中有较高的一致性，如研究组此前发现的LAMP3+ DC和BHLHE40+ Th1-like 细胞[8, 9]。而尽管巨噬细胞在人鼠间的异质性高于其他免疫细胞类群，但在小鼠肿瘤中也存在着与SPP1+ TAM和C1QC+ TAM相似的巨噬细胞亚群。
不同TAM细胞亚群对anti-CSF1R治疗的敏感程度差别迥异。Anti-CSF1R抑制剂会影响处在细胞周期中的巨噬细胞的增殖，其会特异性地删除掉一定比例的具有C1QC+ TAM特征的巨噬细胞，却不会对具有SPP1+ TAM特征的巨噬细胞起到作用，提示anti-CSF1R治疗后保留了在肿瘤中具有促进肿瘤血管生成功能的巨噬细胞，对这群细胞的深入研究将有助于开发新的潜在治疗靶点。
相对地，研究人员发现anti-CD40激动剂对TAM影响较小，而对DC和T细胞亚群有显著的影响。在使用anti-CD40激动剂后，Ccl22+ cDC1/activated DC细胞被大量激活。结合团队此前开发的针对T细胞的分析方法STARTRAC[9], 研究人员发现anti-CD40激动剂会特异性地增强肿瘤内Bhlhe40+ Th1细胞的克隆增生及比例；增强Ccl5+ Tem细胞在淋巴结和肿瘤间的迁移能力，以及该群细胞与Cxcr6+ Trm细胞间的状态转化，提示此群Tem细胞可能具有补充池（Pool）的功能。
综上，该研究在单细胞水平对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群首次进行了系统性的刻画，分析了TAM和DC细胞的类群特征、谱系发育及其与T细胞和其他细胞间相互作用关系。基于以上发现，研究团队深入挖掘了接受anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂治疗的小鼠的肿瘤浸润单细胞图谱，揭示了这两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理。此项国际领先的开创性工作，建立了结合肿瘤患者及小鼠模型的单细胞转录组来研究肿瘤免疫治疗的范例，可为人们研究其他疾病中免疫细胞以及开发新的治疗方案提供思路。
据悉，北大-清华生命科学联合中心CLS博士后张雷博士，北京大学生命科学学院博士生李子逸、Amgen公司Katarzyna M. Skrzypczynska博士为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC，生命科学学院，ICG和CLS张泽民教授、Amgen科学家Jackson G. Egen博士和Xin Yu博士以及北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授为该论文的共同通讯作者。Amgen炎症与肿瘤免疫部负责人欧阳文军博士对此研究提供了宝贵建议。
作者专访
针对此项研究，Cell Press细胞出版社特别邀请了论文的共同通讯作者张泽民教授，文章的共同第一作者张雷博士、李子逸进行了采访，请他们为大家进一步详细解读。
CellPress：
了解肿瘤微环境的复杂性将如何有助于未来的临床试验和当前的治疗计划？细胞亚群特异的免疫治疗策略和联合治疗的前景如何？
张泽民教授：
肿瘤微环境是免疫治疗的“战场”，情况错综复杂，细胞类型多，细胞间相互作用以及动态调控关系都不是很清楚。对这个“战场”不了解透彻的话，很难制定合理的作战方案。而目前肿瘤免疫治疗的瓶颈是不清楚影响这战场中的具体细胞的角色，导致肿瘤免疫治疗是不是成功、跟什么样的方案联合使用，都是很难预测的。
如果我们能把复杂的肿瘤微环境研究得比较透彻，就相当于我们给这个复杂的战场绘制了一个有指导价值的GPS地图，我们才有可能有足够的科学指导，减少随机试错，从而更有效地找到合理化的治疗方案。
近年来，我们通过单细胞的研究陆续找到了一些以前没有看到、或者只有模糊认识的细胞亚型，他们在肿瘤内部特异性地存在，有些类型虽然数量很少却有重要功能，起到了四两拨千金的调控作用。这些可以成为肿瘤免疫中的“靶细胞”。鉴定多种靶细胞后，我们更有可能发现和合理设计一系列的新型联合治疗。
张雷博士：
张老师讲的非常形象透彻了，我补充两个具体例子。一是DC，之前我们肝癌团队发现了一群高表达LAMP3的DC，这群细胞在癌组织中显著富集，并且高表达一系列激活和迁移相关的基因，但功能有待研究。在这项工作中，我们发现这群DC在结直肠癌病人和小鼠癌组织中也存在。意外的是，它们正是对anti-CD40激动剂治疗有特异响应的细胞。
另外一个例子是肿瘤相关巨噬细胞 TAM。TAM通常被认为是肿瘤的“帮凶”。靶向TAM也是研究的热点，anti-CSF1R就是其中之一。我们这项工作研究发现结直肠癌病人中有两群特征差异很大的TAM，其中一群高表达促进血管生成的基因和通路。然而对小鼠进行治疗后，我们意外地发现anti-CSF1R并不能有效的清除这群细胞，这可能也是目前anti-CSF1R单一治疗疗效不佳原因之一。正如张老师所说，我们需要对肿瘤微环境这个“战场”有清晰地认识，才能更精准更有效地治疗。
CellPress：
相比其他巨噬细胞，结直肠癌中肿瘤相关巨噬细胞有何特性？其中SPP1 + TAM的功能是什么？
张雷博士：
通过单细胞测序，我们在结直肠癌中鉴定到了C1QC+ TAM和SPP1+ TAM两群巨噬细胞。与乳腺癌、肺癌等癌种中TAM功能特性表现出来的连续性不同的是，结直肠癌中的这两群TAM呈现出明显的功能异质性。
通过差异表达及通路富集等分析，我们发现C1QC+ TAM细胞可能主要发挥细胞吞噬和抗原呈递的功能，与巨噬细胞的通常功能一致，这也与我们发现的这群细胞在癌组织和粘膜组织中都存在的组织分布特征相吻合；而SPP1+ TAM细胞，也就是我刚提到的高表达一系列促血管生成基因的TAM，则可能具有促进肿瘤血管生成甚至肿瘤转移的功能。
李子逸：
除了张博士提到的基于表达谱层面的差异，我们通过对细胞间相互作用网络的分析发现，C1QC+ TAM主要与多种T细胞亚群发生相互作用，而SPP1+ TAM则主要与肿瘤相关成纤维细胞CAF和血管内皮细胞发生相互作用，进一步印证了这两群TAM可能具有不同的功能。整合已发表的单细胞转录组数据，我们发现C1QC+ TAM同时存在于肠炎病人及健康受试者的肠道组织中，而SPP1+ TAM 则特异性地富集在结直肠癌病人的癌组织中，进一步说明这群细胞在结直肠癌肿瘤发生和进展中有非常重要的作用，可能是真正的肿瘤“帮凶”。
刚张博士也提到关于TAM的靶向治疗。我们对结直肠癌病人和小鼠的单细胞转录组数据进行比较分析后发现，小鼠肿瘤组织中也存在着分别具有C1QC+ TAM和SPP1+TAM特征的巨噬细胞，后者也同时会高表达Vegfa和Cd274等利于肿瘤生长的基因。而anti-CSF1R抑制剂只会特异性地删除掉一定比例的具有C1QC+ TAM特征的巨噬细胞，却不会对具有SPP1+ TAM特征的巨噬细胞起到作用。因此，对SPP1+TAM细胞的后续深入研究将有助于我们发现更多的潜在的治疗靶点。
CellPress：
肿瘤中的细胞相互作用网络与正常组织中的有何不同？
张雷博士：
目前，计算细胞间相互作用网络的算法主要依赖于各细胞配体/受体的表达情况，但是该类算法往往会得出较为冗余的作用网络，较难细致地描绘细胞类群间的相互作用关系。主要原因有二：一方面，人们对多数配体/受体结合动力学的了解较少，难以在计算中进行准确的模拟；另一方面，计算中也很少考虑到受相应受体调控的下游基因的表达情况。
因此在这项工作中，我们利用单细胞测序数据对肿瘤微环境中各细胞亚群特征的精确描绘，结合TCGA和GTEx公有的肿瘤样本和正常组织样本数据，在结直肠癌和粘膜组织中分别构建了细胞间的相互作用网络，下面请子逸给大家介绍一下两种组织中的相互作用网络有何不同。
李子逸：
具体来说，我们利用Smart-seq2数据中各细胞类群的特征基因集及TCGA和GTEx数据集中的bulk样本，对各细胞类群间的相关性进行了计算，并进而在癌旁组织和肿瘤内构建出“相关性关系网络”。
由于癌旁组织和肿瘤中分别富集不同的细胞类群，二者的细胞相互作用网络也存在着较大的差异。在癌旁组织中，可以观察到B细胞和Tfh细胞以及DC细胞间的相互作用，这很可能反映了肠组织中生发中心的发育过程。
在肿瘤中，细胞间相互作用网络可以被分为两个区块，在第一个区块中可以观察到T细胞、DC细胞和C1QC+ TAM细胞间复杂的相互作用关系，反映了肿瘤免疫中T细胞的杀伤功能及所受到的调控；SPP1+ TAM、CAF细胞和血管内皮细胞间的相互作用则构成了第二个区块，反映了肿瘤中血管生成的过程。
张泽民教授：
子逸讲的很清楚，另外需要强调的一点是，基于配体/受体计算细胞间相互作用网络同样十分重要，可以给我们提供另一层面的信息，比如细胞间分子水平的相互作用，我们也在这方面持续的优化。
CellPress：
抗CD40治疗对肿瘤组织中的CD8+ 和CD4+ T细胞亚群分别有什么作用？这些发现表明了什么？
张雷博士：
正如我们刚才提到的关于anti-CD40激动剂的机制研究，我们通过单细胞转录组的分析发现，这个治疗会特异性地激活小鼠肿瘤中的Ccl22+ cDC1细胞。DC细胞的主要功能是提呈抗原给T细胞，促进T细胞分化，那么anti-CD40激动剂的抗肿瘤效果是否有T细胞参与？是哪一群T细胞呢？
我们首先在构建的结直肠癌“相互性关系网络”中找到了一些线索，分析发现除了CD8+ T细胞，激活的cDC1细胞也与BHLHE40+ Th1-like细胞有相互作用。有意思的是，我们在小鼠接受治疗前后的单细胞数据中观察到了这一现象。Anti-CD40激动剂治疗2天后，小鼠肿瘤中浸润的Bhlhe40+ Th1-like细胞即有大幅提升，对于CD8+ T细胞，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm细胞在治疗后第10天比例上升。虽然CD8+ 耗竭T细胞的比例没有显著变化，但耗竭相关的基因和蛋白均有一定程度的下降。
那么anti-CD40激动剂是如何影响T细胞变化的？我们使用团队之前开发的STARTRAC分析方法，发现Bhlhe40+ Th1-like细胞的增多主要是治疗后发生了大量克隆增生，提示其可能发挥抗击肿瘤的作用。而Ccl5+ Tem细胞在肿瘤内和淋巴结间的迁移，以及与Cxcr6+ Trm的状态转化在治疗后均有增强，提示这群细胞可能与最近报道的stem-like T细胞相似，可作为细胞库补充抗击肿瘤的“兵力”。
李子逸：
关于激活的DC和Th1-like细胞是否有直接的相互作用，我们除在单细胞水平进行分析及OTII体外实验外，还在TCGA数据上进行了探索。之前，张雷博士的T细胞工作发现了在MSI病人中特异性地富集这群高表达BHLHE40，IFNG和CXCL13的Th1-like细胞，推测其可能与免疫治疗响应相关。我们这个工作发现MSI病人中也显著富集活化的DC细胞，并且与Th1-like细胞比例有很强的相关性，提示anti-CD40激动剂治疗可能对既往anti-PD1治疗响应不佳的结直肠癌病人有一定效果，但其具体应用还需要大量的基础和临床试验研究。
CellPress：
您们团队间是怎样的合作方式？进一步研究的研究计划如何？
张泽民教授：
我们非常感谢合作方北京大学人民医院的申占龙研究组和Amgen的多位科学家，他们提供了大量和无私的贡献。对于这种多方合作、多角度研究的大项目，不同课题组之间的高效协同作业，最大限度地发挥每个团队的力量是整个项目顺利开展的关键因素。申占龙医生提出了临床问题并提供了宝贵的临床样本，与我们一起探索了项目的具体实施细节，包括病人入组条件、取样要求等。
我们实验室除了完成单细胞转录组的高质量测序工作，同时发挥了生物信息学分析的优势，尝试新的分析方法，对数据进行深度挖掘。到项目后期，则需要对分析结果进行体内和体外的生物学验证。Amgen多位科学家产生了不同的小鼠单细胞转录组数据，交由我们团队进行分析和深度挖掘，并贡献到我们的研究中，这构成了我们合作的基础。为了遵循中国遗传办关于中国遗传信息保护的新规定，避免与国外合作方分享任何中国病人的临床信息以及遗传信息，我们采取了只进不出的单向分享方法，即只对Amgen共享深度挖掘和整合的小鼠数据，这同时也保障了我们的知识产权，做出了由北大科研团队引导的在肿瘤免疫领域及应用转化方面的突破研究。
在这个研究的基础上，我们也希望能够继续研究肿瘤微环境和免疫治疗疗效的相互作用，继续揭示和癌细胞生长相关的基质细胞的特点，包括分型、发育、细胞间相互调节，以及他们在各种治疗过程中的动态变化。希望这些前沿基础研究能为中国肿瘤免疫发展起到一定的推动作用。
第一作者介绍
张雷
博士
张雷，博士，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）/北京大学-清华大学生命科学联合中心（CLS）博士后，博士毕业于北京大学分子医学研究所，2016年加入BIOPIC/CLS, 从事结直肠癌肿瘤微环境单细胞功能与组学技术应用研究，合作导师为张泽民教授。博士后期间，首次在单细胞层面系统性地解析结直肠癌浸润T细胞的转录组及TCR组库特征；与团队共同开发了STARTRAC生物信息学追踪方法，对结直肠癌T细胞的组织分布特性、克隆性、迁移性和状态转化进行全面刻画；首次从单细胞层面解析了MSI和MSS结直肠癌病人的T细胞亚型差异，鉴定的新的T细胞类群及特征展现出在肿瘤免疫治疗领域的巨大应用潜力 （Zhang et al., Nature, 2018）。成果同年入选“中国生物信息学十大进展”（2018），并受邀在Cancer Immunology Research（2019）和Journal of Leukocyte Biology（2020）上对相关工作及领域进行综述与展望。2016年获北大-清华生命科学联合中心博士后基金资助；2018年获北京大学优秀博士后奖；2019年获拜耳-北京大学转化医学研究中心拜耳博士后奖。
通讯作者介绍
张泽民
教授
张泽民， 北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）与北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）研究员，北京大学生命科学学院讲席教授，北大清华联合中心高级研究员。1988年本科毕业于南开大学，经CUSBEA赴美留学, 于1995年在宾州州立大学获得生物化学和分子生物学博士学位。在旧金山加州大学进行博士后研究工作后，于1998年任职于美国Genentech公司，开始生物信息和癌症基因组研究工作，曾任系主任、生物信息首席科学家。2014年加入北京大学，致力于生物信息、癌症基因组和肿瘤免疫研究。
他的实验室目前正利用前沿的实验技术和生物信息学方法进行肿瘤及其微环境的异质性、耐药性、以及免疫细胞和肿瘤细胞的相互作用等方面的研究。2018年作为创始人建立百奥智汇科技有限公司，致力于挖掘单细胞基因组学和生物信息学在人类疾病诊断和治疗上的应用。张泽民教授已多次在Cell、Nature、Nature Genetics、Nature Biotechnology、Nature Medicine等国际著名杂志上发表论文，并担任多家专业杂志的编委，包括"Cell Systems", "Genome Medicine"和"Cell Reports"。
本文参考文献（上下划动查看）
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相关论文信息
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▌论文标题：
Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(20)30341-X.pdf
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.048
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